AAT熒光染料相關(guān)問題

1、AAT熒光染料與傳統(tǒng)染料相比有何優(yōu)勢？

iFluor系列染料與傳統(tǒng)染料如 Cy3 Cy5 Cy7（from GE）相比水溶性好穩(wěn)定性高PH不敏感、亮度高、價格低、背景值低，可以完美替代。

2、抗體標(biāo)記的原理是什么？

對于iFluor系列的 SE（琥珀酰亞胺酯）染料，SE與抗體的氨基反應(yīng)生產(chǎn)穩(wěn)定的酰胺鍵；而對于APC、PE、HRP等大蛋白分子，預(yù)活化好的FOL的大蛋白，與需要連接在抗體上的MTA特異性結(jié)合。

3、標(biāo)記好的抗體4度條件下可以儲存多久？

標(biāo)記好的抗體當(dāng)濃度大于等于1mg/ml，4度可儲存一年，當(dāng)抗體濃度在0.1-0.5mg/ml時，可以加入0.2%BSA保存。

4、染料的保質(zhì)期是多久？

在產(chǎn)品備注的儲存溫度條件下，以開封日起可存放一年。PS:DMSO 溶液不是很穩(wěn)定，需要無水 DMSO，避免凍融循環(huán)。

5、標(biāo)記的抗體或者蛋白大小有要求嗎？

建議不要小于20KD

6、有哪些抗體不適合用于標(biāo)記？

不適合包含牛白蛋白血清（BSA），明膠，游離氨基酸(L-組氨酸)或銨鹽的抗體或蛋白質(zhì)。

7、去除疊氮化鈉、硫酸銨或醋酸銨等這些雜質(zhì)成分用什么？

只需要Cat#60502 spin filter一個柱子可去掉所有的這些雜質(zhì)。

8、在標(biāo)記大蛋白使用的MTA，必須搭配使用MTA清除劑使用嗎？

可以不用，因為這個group細(xì)胞里是沒有的。

9、 一抗抗體上可以結(jié)合幾個熒光素？不同抗體會不會鏈接上的熒光數(shù)量不同？

相同條件不會連的熒光數(shù)量不同，一般在2-4之間，不同的熒光染料略有不同。DOS＞４以后亮度增加不多，會更亮一些，但背景值可能會增加。對于不易淬滅的熒光可以標(biāo)記到6。

10、標(biāo)記的效率如何檢測？

iFluor 的標(biāo)記我們是測純化后的dye/protein ratio，也有客戶用 Run SDS Gel的方法。

Buccutite的效率我們是用SEC的column來測的。

11、iFluor系列染料標(biāo)記蛋白會不會影響被標(biāo)記蛋白和別的蛋白的相互作用？

不會

12、AAT市售的抗體不同應(yīng)用的抗體推薦稀釋比是多少？

Western Blot (WB): 1μg/ml，Immunofluorescence (IF): 2-10 μg/mL ，F(xiàn)low Cytometry (Flow):  2-10 μg/mL

13、用AAT熒光標(biāo)記的抗體更亮的原因是什么？

結(jié)構(gòu)不同，在于熒光做了修飾，容易鏈接到抗體上而不易發(fā)生淬滅，比如一個抗體IF594能標(biāo)4-6個，而AF594只有2-3個。

14、染料和蛋白的比例大概是多少？

大約摩爾比為1：15，在抗體濃度是1mg/ml時。

15、最常見的succinimidyl ester（琥珀酰亞胺酯）和Maleimide活性集團結(jié)合在抗體的什么部位？

SE跟抗體的-NH2連接形成類似于肽鍵的結(jié)構(gòu)，從而連接到抗體上，這是最簡便的連接方式；Maleimide活性基團與巰基（-SH）結(jié)合，優(yōu)點是只標(biāo)記抗體Fc片段不會影響抗原抗體的結(jié)合部位。

16、抗體標(biāo)記DPR值(抗體和熒光蛋白的比例)的參考范圍有沒有推薦？

這個與抗體和dye的比例有關(guān)，也與抗體的濃度有關(guān)，請參考不同染料的說明書，里面有建議的比例。

17、標(biāo)記過后用什么柱子純化？

貨號為60500的柱子純化。

18、AAT iFluor熒光染料是否有自己的專利？我使用iFluor在自己的產(chǎn)品上時是否需要支付版權(quán)費用？

我們可以提供專利證明文件。從達科為購買AAT熒光染料，無需支付版權(quán)費。

19、MTA和FOL組合與SMCC標(biāo)記大蛋白方法的最大優(yōu)勢是什么？

交聯(lián)劑的一端（通過NHS酯）與氨基酸賴氨酸和N-末端中發(fā)現(xiàn)的胺（-NH2）反應(yīng)，另一端（通過馬來酰亞胺）與氨基酸中發(fā)現(xiàn)的硫醇基團（-SH）反應(yīng)半胱氨酸。然而，SMCC修飾的蛋白質(zhì)極不穩(wěn)定并且通常是自身反應(yīng)性的，因為蛋白質(zhì)通常含有胺和硫醇基團，其引起顯著量的自交聯(lián)。

操作簡單的抗體標(biāo)記試劑盒問題

20、我的抗體中含有甘油可以用抗體標(biāo)記試劑盒嗎？

甘油最好20% 以下

21、iFluor系列抗體標(biāo)記試劑盒中的淬滅劑為什么可以淬滅掉沒連接在抗體上的熒光，而標(biāo)記在抗體上的熒光卻不會被淬滅？

因為淬滅劑和未結(jié)合上的熒光是分子內(nèi)的淬滅，而連在抗體上的熒光，是分子間的淬滅，只有很高濃度才會被淬滅。

22、抗體標(biāo)記試劑盒的淬滅劑的成分是什么，可以單獨購買嗎？

淬滅劑是一種小分子，可以單獨購買，貨號為“標(biāo)記試劑盒貨號+C”，例如1255C。

23、抗體標(biāo)記試劑盒的淬滅劑可以淬滅APC、PE 這種大蛋白嗎？

不推薦，建議使用60500柱子純化。

24、我要做體內(nèi)實驗擔(dān)心抗體標(biāo)記試劑盒中的淬滅劑會影響實驗怎么辦。

1）不加淬滅劑，加10mM Glycine buffer 可以， 這樣dye 就沒有活性了。

2）可以用10K filter把小分子的dye 除去。

 https://www.aatbio.com/products/readiuse-10kd-spin-filter?unit=60502

25、iFluor系列染料和Buccutite試劑盒，標(biāo)記蛋白或抗體的效率分別是多少呢？

iFluor 的標(biāo)記是全標(biāo)記上了，但是Buccutite的效率應(yīng)該在80%以上。

26、Readlink試劑盒的reaction buffer成分是什么？

可以用1.0M NaHCO3 buffer or Phosphate buffer (pH=8.5)來調(diào)pH

27、iFluor系列抗體標(biāo)記盒，我每次標(biāo)記不了50ug，每次標(biāo)記可不可以小于50ug？

可以小于50ug, dye用DMSO溶，等比例減少用量， 但是剩下的dye量很少，可能不太穩(wěn)定。

28、如果我的抗體含有少量的BSA，是否可以使用抗體標(biāo)記試劑盒？

可以，我們有BSA兼容的ReadiLink? xtra 系列抗體標(biāo)記試劑盒，但是BSA的含量要在0.5%以內(nèi)的標(biāo)記效果是最好的。

 番 外：

1. 關(guān)于60502 這個產(chǎn)品的用法很靈活，主要有以下三方面的用途：

1）Concentrate volume （濃縮）

2）Desalting （除鹽，或除去小分子）

3）Deproteinization of biological samples （除蛋白）

從第二個用途來說和60500柱的用途是一樣的。但是推薦用60500，會除小分子更快更干凈一些。

2. 標(biāo)記大蛋白SMCC方法簡要步驟： APC/SMCC和抗體/DTT分別過柱子,混合,封閉,濃縮,檢測。APC在標(biāo)記前需要過柱子成PBS緩沖液；SMCC現(xiàn)用現(xiàn)配。

3. IgG的大小是150Kd

4.不同染料對比數(shù)據(jù)

5. 不同染料基本信息

6. 工業(yè)客戶推薦簡要的“原汁原味”Protocol實例

1) iFluor594, NHS, 1mg/vial, add 100uL anhydrous DMSO to prepare 10mg/ml solution.

2) Prepare Antibody 5mg/ml in PBS, 100uL

3) Add  5ul 1.0M NaHCO3 (pH=8.5-9.0) to adjust pH to 8.5-9.0

4) Add 3.9uL 10mg/ml  iFluor594, SE stock solution (10X labeling ratio)

5) Mix well, incubate at room temperature for 60min

6) Set up Spin column (Cat#60500), equilibrate column with PBS buffer

7) Collect elution

8) Measure Absorbance A280nm  and A594nm

https://www.aatbio.com/tools/degree-of-labeling-calculator

Target DOS >4

9) If DOS is lower than 4, need to add iFluor594, SE and relabel the conjugate until it reaches the target DOS.

7. 10mg/ml 每次標(biāo)記20mg抗體實例

1) 10mg/ml in PBS, 2mL, Add 100uL reaction buffer to adjust pH

2) Dissolve iFluor488, SE in DMSO to make 10mg/ml

3) Add 8 eq. mole iFluor488, SE to IgG solution

4) Reaction for 60min

5) Pack 2 PD-10 columns (10mL gel/column)

6) Load 1mL reaction mixture,

7) Spin to purify the mixture

8) Collect the purified IgG-iF488 conjugate.

PD-10珠子的材料是聚丙烯酰胺，建議純化1500以下的小分子與分子量大于15，000以上的蛋白。